Inną czołową uczelnią był Uniwersytet Wileński (Akadema Wileńska), który ustanowił w 1578 roku król Stefan Batory, a zatwierdził w 1579 roku papież Grzegorz XIII. Miał on wydziały teologii, filozofii oraz sztuk wyzwolonych (przez krótki czas był także wydział prawny). Uniwersytet Wileński powstał z przekształcenia działającego od 1570 roku kolegium jezuickiego, prowadzony był przez jezuitów i zorientowany na walkę z reformacją. Pierwszym jego rektorem był Piotr Skarga. Po kasacie zakonu jezuitów w 1773 roku, opiekę nad uczelnią przejęła Komisja Edukacji Narodowej. Przemianowała ona dotychczasową Akademię Wileńską na Szkołę Główną Wielkiego Księstwa Litewskiego. Uniwersytet w Wilnie kształcił przede wszystkim nauczycieli dla szkół średnich na terenie Litwy (nad którymi sprawował nadzór). Po ostatnim rozbiorze przemianowano go na Szkołę Główną Wileńską, a w 1803 roku na Cesarski Uniwersytet Wileński. Po 1803 roku, dzięki działalności księcia Adama Jerzego Czartoryskiego i Jana Śniadeckiego (rektora w latach 1807-1815) stał się głównym ośrodkiem nauki polskiej, a także najlepszą uczelnią w cesarstwie rosyjskim. Wysoki poziom reprezentował szczególnie w naukach ścisłych, medycynie i historii. Profesorem Uniwersytetu Wileńskiego był m.in. Joachim Lelewel, do grona wychowanków zaś należeli na przykład poeci Adam Mickiewicz i Juliusz Słowacki oraz pisarz Józef Ignacy Kraszewski. Uniwersytet zlikwidowano w wyniku represji po upadku powstania listopadowego – z wydziału lekarskiego utworzono Akademię Medyko-Chirurgiczną (zamkniętą w 1841 roku), a z wydziału teologicznego – Akademię Duchowną (przeniesioną w 1842 roku do Petersburga). Jako Uniwersytet Stefana Batorego reaktywował go w 1919 roku naczelny wódz wojsk polskich Józef Piłsudski. W październiku 1939 roku Uniwersytet Wileński przeszedł pod zarząd litewski. Po wkroczeniu Armii Czerwonej do Wilna w czerwcu 1940, duża część profesorów polskich została aresztowana i deportowana w głąb ZSRR – po zakończeniu wojny większość pozostałych przy życiu podjęła pracę na Uniwersytecie Mikołaja Kopernika w Toruniu. Od uzyskania przez Litwę niepodległości w 1990 roku, Uniwersytet Wileński jest czołową uczelnią tego kraju.